Un nouveau système de diagnostic au point de soins sur papier, peu coûteux, pour l'évaluation de la fonction hépatique.

ABSTRAIT

L'analyseur biochimique, outil important d'évaluation quantitative des lésions hépatiques, est une méthode de test conventionnelle. Cependant, son utilisation reste limitée dans les pays à revenu faible ou intermédiaire (PRFI) en raison du manque de personnel, de financements et de contraintes environnementales. Acquérir rapidement des informations sur les lésions hépatiques grâce à une méthode simple et efficace, fournissant une aide précieuse à la décision clinique, demeure un défi pour les PRFI. Pour y remédier, nous avons conçu un système de diagnostic au chevet du patient innovant et facile d'utilisation. Ce système comprend un dispositif de détection basé sur un capteur photochimique macro à deux photons et une carte de test sur papier intégrant un système de filtration des cellules sanguines. La structure à deux photons permet de réduire le volume et le coût du système, et compense les erreurs inter-stations liées à l'assemblage de l'instrument. Le système de filtration des cellules sanguines simplifie la procédure : le sang est filtré, réagit et change de couleur directement sur la carte de test. Le dispositif de détection acquiert le signal de réflexion lumineuse continue de la carte de test sur papier et le quantifie afin de réaliser le test quantitatif des indices de lésions hépatiques. Nous avons simulé l'environnement national des pays à revenu faible et intermédiaire pour évaluer les performances du système : dans un environnement à 35 °C et 90 % d'humidité relative, avec 40 échantillons de sang total hépariné, la corrélation R² La concordance entre notre système et le Mindray BS350s était supérieure à 0,95. Les coefficients de variation (CV) de répétabilité des niveaux 2 et 3 du contrôle qualité Randox étaient tous deux inférieurs à 7,5 %. Ces résultats démontrent que le système, outre sa taille compacte, son faible coût et sa simplicité d'utilisation, offre des performances et une stabilité de mesure conformes aux exigences cliniques des environnements à température et humidité élevées. Il peut donc être utilisé dans les pays à revenu faible et intermédiaire pour le dépistage primaire des troubles hépatiques et l'évaluation de la progression des maladies du foie.

Mots clés : Spectre de réflexion ; Capteur photochimique ; Traitement multi-signaux ; Détection rapide des lésions hépatiques ; Analyseur POCT ; Pays à revenu faible et intermédiaire

1. INTRODUCTION

Les maladies du foie sont devenues un fardeau considérable pour la santé publique mondiale, tuant plus de 2 millions de personnes chaque année dans le monde.^1,2Une grande partie de ces décès peuvent être traités (comme l'hépatite B chronique), guéris (comme l'hépatite C chronique) ou évités (comme l'insuffisance hépatique d'origine médicamenteuse) grâce à un diagnostic et un traitement précoces.³Le diagnostic des maladies hépatiques repose actuellement sur des méthodes non invasives telles que l'échographie et l'imagerie élastique instantanée, ainsi que sur le dosage des marqueurs biochimiques sanguins. Cependant, ces techniques diagnostiques nécessitent un équipement sophistiqué et un personnel qualifié, souvent indisponibles dans les pays à revenu faible ou intermédiaire (PRFI) aux ressources limitées, ce qui rend la détection, le diagnostic et le suivi des lésions hépatiques très difficiles.^4-7Il peut en résulter que de nombreuses personnes restent non diagnostiquées jusqu'à un stade avancé de la maladie, ce qui entraîne des retards importants dans la prise de décision clinique et des coûts considérables pour le traitement ultérieur. De nombreux chercheurs ont reconnu le problème du dépistage des maladies hépatiques dans les pays à revenu faible et intermédiaire.³et ont souligné le besoin urgent de développer une méthode rapide, efficace et portable pour mesurer rapidement les lésions de la fonction hépatique dans ces pays.

*liyingchun@konsung.com;

Les trois biomarqueurs que sont l'alanine aminotransférase (ALT), l'aspartate aminotransférase (AST) et l'albumine (ALB) sont couramment utilisés pour le diagnostic clinique des lésions hépatiques. L'élévation de l'un ou des trois est l'anomalie la plus fréquente observée lors des tests de la fonction hépatique. Le dosage de l'ALT, de l'AST et de l'ALB permet un diagnostic préliminaire des lésions hépatiques et l'évaluation de la progression des maladies du foie.^8-13Il existe actuellement deux types d'appareils de chimie clinique approuvés par la FDA pour l'analyse de la fonction hépatique, couramment utilisés dans les pays à revenu faible et intermédiaire : le LDXH (Alere, San Diego, Californie) et le Roche ReflotronH Plus (Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana). Ces deux appareils permettent de mesurer les taux d'ALT et d'AST à partir d'un prélèvement de sang capillaire, sans séparation préalable du sérum. Cependant, pour les pays à revenu faible et intermédiaire aux ressources limitées, leur coût est prohibitif (équipement : 3 000 à 6 000 dollars américains ; réactifs : plus de 4 dollars américains).¹⁴ et complexes à mettre en œuvre, nécessitant des techniciens bien formés, une alimentation électrique stable et le test d'un seul marqueur à la fois.

Nous avons développé une plateforme de détection rapide et une carte de test pour la mesure ponctuelle des enzymes ALT, AST et ALB par photométrie de réflectance. Ce système, adapté aux pays à revenu faible et intermédiaire, présente l'avantage d'être peu coûteux, très simple d'utilisation, compatible avec les prélèvements de sang total ou capillaire et indépendant de l'alimentation électrique du laboratoire. Il s'agit d'un système de test portable au point de soins (POCT) comprenant un analyseur POCT et la carte de test papier correspondante. Le sang à analyser est acheminé vers une zone spécifique, puis les cellules sanguines sont progressivement filtrées. Une réaction enzymatique et une coloration se produisent alors. Enfin, la courbe spectrale de réflectance de la carte de test papier, obtenue grâce au dispositif POCT, est analysée afin de déterminer la concentration d'ALT, d'AST et d'ALB. Les avantages considérables que représentent le faible coût, la facilité de portabilité de l'appareil, l'absence de restrictions quant au lieu de test et la rapidité d'exécution contribueront à étendre et à décentraliser les services de dépistage, d'évaluation et de traitement cliniques des maladies du foie dans les pays à faible revenu, et ce système apportera un soutien important à la réalisation de tests à grande échelle dans les pays à faible revenu disposant de ressources économiques limitées.

2. MÉTHODES

2.1 Principes
Ce système est basé sur la théorie de Kubelka-Munk (théorie KM). La théorie KM est généralement utilisée pour l'analyse des spectres de réflectance diffuse obtenus à partir d'échantillons faiblement absorbants, établissant une corrélation entre la réflectance et la concentration. La concentration d'une espèce absorbante peut être déterminée à l'aide de la formule de Kubelka-Munk :
 

Où R = réflectance, k = coefficient d'absorption, s = coefficient de diffusion, c = concentration de l'espèce absorbante et A = absorbance¹⁵.

Le sang réagit dans la zone de test de la carte de test en papier, ce qui entraîne un changement de couleur. L'intensité de ce changement est proportionnelle à la concentration en substance. Selon la théorie de Kaplan-Meier, pour une série de dispositifs de test de même matériau et d'épaisseur identique, irradiés par la même source lumineuse, k est proportionnel à la concentration c de la substance, F(R) est également proportionnel à c, et la concentration de l'espèce absorbante peut alors être quantifiée par la valeur de la réflectivité.


2.2 Tests de la fonction hépatique sur papier
Les cartes de test sur papier sont composées de plusieurs couches de papier à motifs (Figure 1), chaque couche ayant des fonctions et des matériaux différents. Ces couches sont assemblées verticalement par des matériaux polymères pour former une carte de test réactive. La couche supérieure utilise une gaze hydrophile isotrope pour créer un canal microfluidique hydrophile acheminant le sang vers la zone de détection dédiée à la séparation et à l'analyse du plasma. La carte de test comporte quatre zones indépendantes : trois zones de test, permettant de mesurer respectivement l'ALT, l'AST et l'ALB ; la quatrième zone sert à identifier les anomalies et à garantir le bon fonctionnement du dispositif. Chaque zone possède un environnement spécifique (réactifs, tampons, indicateurs, etc.) afin d'assurer un processus de mesure rapide et indépendant. Grâce à ce système, le temps total, de l'ajout de l'échantillon à la fin de la réaction, est inférieur à 3 minutes. Le dosage de l'ALT et de l'AST repose sur la méthode à la peroxydase.¹⁶et ALB selon la méthode au vert de bromocrésol¹⁷L'analyseur quantifie la concentration de la substance à mesurer en enregistrant le changement de couleur de la carte de test.^18,19.

Figure 1. Structure de la carte de test sur papier (à gauche) et changement de couleur des cartes de test pour l'ALB, l'AST et l'ALT respectivement 3 minutes après l'ajout de l'échantillon.

2.3 Plateforme de tests de la fonction hépatique à faible coût et réalisable au point de soins
Le dispositif POCT (Dispositif de Test au Point de Soins) permet de détecter les changements de couleur des cartes de test sur papier et de les convertir en concentrations. Il comprend un module d'échantillonnage, un module de détection photoélectrique, un module d'analyse du signal, un module d'alimentation et un module d'affichage. Chaque module est conçu indépendamment pour faciliter la maintenance. Le module d'échantillonnage sert à fixer la carte de test, tandis que le module photoélectrique acquiert diverses informations et les convertit en signaux électriques. Après insertion de la carte de test sur papier dans le module d'échantillonnage, des gouttes de sang sont déposées. Le sang pénètre dans la carte, subit une séparation de la pulpe sanguine et une réaction chimique, puis les changements de couleur générés sont détectés par le module de détection photoélectrique. Grâce au modèle de conversion signal-concentration du module d'analyse du signal, les concentrations d'ALT, d'AST et d'ALB sont obtenues et affichées.

Pour le module de détection photoélectrique, élément central d'un dispositif POCT, nous avons spécialement conçu un capteur photochimique diffus à double source lumineuse biphotonique à quatre canaux, de la taille d'une pièce de monnaie. Chaque canal comprend deux sources lumineuses de longueurs d'onde différentes, deux sources lumineuses de même longueur d'onde et un capteur de réception, comme illustré sur la figure 2. Contrairement aux équipements biochimiques conventionnels, ce capteur photochimique miniature est conçu pour une faible consommation d'énergie et, grâce à son alimentation par batterie au lithium, il s'affranchit des contraintes d'une alimentation secteur classique. La portabilité et l'applicabilité du dispositif s'en trouvent ainsi améliorées. Après traitement par la lentille, la lumière émise par la double source lumineuse éclaire la surface du sujet à mesurer. La lumière réfléchie par le sujet est collectée par le capteur après traitement par la lentille, puis convertie en un signal électrique et enregistrée en fonction de la longueur d'onde. Le capteur reçoit alors la superposition des signaux provenant des sources lumineuses situées à ses extrémités gauche et droite, le signal réfléchi étant amplifié. La distance entre les deux sources lumineuses étant prédéfinie, leurs signaux réfléchis respectifs sont complémentaires. Grâce à cette conception, les différences de signal entre les différentes stations, dues aux erreurs de distance lors de l'assemblage de l'instrument, sont minimisées. Il n'est donc plus nécessaire d'étalonner les différents équipements, ce qui réduit les coûts de production. De plus, la maintenance des équipements après leur sortie d'usine est simplifiée et facilitée.

Figure 2. Le module de détection photoélectrique et le schéma du capteur photochimique macro à deux photons monocanal.

2.4 Conception de l'étude
Afin de vérifier la faisabilité de cet équipement dans les pays à revenu faible et intermédiaire, nous avons testé la précision des mesures sur sang total et la répétabilité du contrôle qualité Randox dans un environnement à 90 % d'humidité relative et à 35 °C. Les échantillons de sang total hépariné sodique ont été prélevés en mai 2023 à l'hôpital populaire n° 3 de Zhenjiang. Chaque échantillon a été divisé en deux : l'un a été centrifugé puis analysé sur l'automate Mindray BS350s (Mindray, Shenzhen, Chine) à température ambiante ; l'autre a été analysé avec le système de diagnostic délocalisé (POCT) proposé dans cet article, à 90 % d'humidité relative et à 35 °C. Les résultats ont été enregistrés. Le contrôle qualité Randox (Randox, Irlande du Nord, Royaume-Uni) de niveau 2 (lot 1503UN) et de niveau 3 (lot 1223UN) a été testé à 35 °C et à 90 % d'humidité relative avec l'analyseur POCT et les cartes de test, et ce à 10 reprises.

2.5 Analyse statistique
L'analyse des données et la génération des graphiques de régression ont été réalisées à l'aide d'Excel 2013. Les graphiques de régression ont été tracés et le coefficient de corrélation R a été calculé.² ont été calculés pour les différences observées dans les résultats entre le système de cette étude et MindrayBS350s, le coefficient de variation (CV) a été calculé pour évaluer les performances de mesure.

3. RÉSULTATS

3.1 Conditions de fonctionnement et performances du test
Dans les 40 cas de sang hépariné, la corrélation, R²Les coefficients de corrélation (R²) des valeurs d'ALT, d'AST et d'ALB mesurées avec le MindrayBS350s étaient respectivement de 0,9909, 0,9918 et 0,9913 à 35 °C et 90 % d'humidité relative, comme illustré à la figure 3. Les R² des trois paramètres étaient tous supérieurs à 0,95, ce qui indique une bonne corrélation entre les résultats obtenus avec l'appareil et ses réactifs et ceux de l'analyseur biochimique clinique MindrayBS350s dans cet environnement.

Figure 3. Corrélation avec le MindrayBS350s pour l'ALT, l'AST et l'ALB complets à 35°C et 90% d'humidité relative.

3.2 Précision
La précision intra-lot, également appelée répétabilité, indique l'erreur de mesure au sein d'un même lot. Elle est déterminée de manière répétée par le même opérateur sur le même échantillon. À 35 °C et 90 % d'humidité relative, la précision de l'équipement et des cartes de test est évaluée à l'aide du contrôle qualité Randox afin de vérifier que l'environnement introduit des erreurs aléatoires négligeables. Les résultats sont présentés dans le tableau 1 : le coefficient de variation (CV) du contrôle qualité Randox est de 5,8 % pour l'ALT (niveau 2) et de 4,5 % pour le niveau 3 ; pour l'AST (niveau 2), il est de 6,5 % et de 2,5 %. Pour l'ALB (niveau 2), il est de 5,7 % et de 7,3 %. Les valeurs obtenues pour l'ALT et l'AST sont conformes aux normes chinoises de l'industrie des analyseurs chimiques à sec.²⁰Le coefficient de variation (CV) des enzymes ALT et AST, dans la plage de concentrations de 40 à 60 U/L, est inférieur ou égal à 12 %, et le CV, dans la plage de concentrations de 100 à 300 U/L, est inférieur ou égal à 5 ​​%. Tous ces analytes satisfont à l'exigence d'un CV inférieur à 7,5 % mentionnée dans le manuel de la plupart des analyseurs biochimiques POCT secs disponibles sur le marché. Les résultats montrent que, dans des conditions de 35 °C et 90 % d'humidité relative, le CV de l'appareil et de la carte de test est acceptable, et l'erreur aléatoire de la carte de test dans ces conditions est acceptable.
 
Tableau 1 Expérience de contrôle qualité Randox ALT, AST et ALB et résultats.

4. DISCUSSION ET CONCLUSIONS

Les analyseurs biochimiques sont utilisés depuis des décennies comme méthode de référence pour la détection des marqueurs hématologiques du foie, tels que l'ALT, l'AST et l'ALB. Après prélèvement de sang veineux périphérique, celui-ci est transporté vers un laboratoire central où le sérum est séparé par des techniciens qualifiés et analysé par un analyseur biochimique. Ces méthodes de détection, en apparence simples, sont très difficiles à mettre en œuvre dans les pays à revenu faible et intermédiaire (PRFI) en raison du coût élevé du matériel, de la nécessité d'un environnement de test stable et du besoin de techniciens qualifiés pour réaliser les analyses et assurer la maintenance. De plus, même si la détection est possible, la dispersion géographique des populations dans les PRFI retarde l'obtention des résultats.

Cet article présente un système de détection rapide et peu coûteux des indices de lésions hépatiques. Ce système est comparé aux dispositifs de diagnostic au point de soins existants et aux études publiées précédemment. ^{21, 22, 23}Nos dispositifs de diagnostic au point de soins (POCT) permettent d'effectuer simultanément des tests quantitatifs d'ALT, d'AST et d'ALB. Grâce à leur faible consommation d'énergie et à leur batterie au lithium, ces tests peuvent être réalisés à tout moment et en tout lieu, indépendamment de l'alimentation électrique du site de test. Le prélèvement de sang périphérique étant direct, aucune centrifugation complexe n'est nécessaire. Après une formation simple, les agents d'hygiène de base peuvent réaliser le test avec précision. Le coût est inférieur à 700 $ par instrument et celui des cartes de test papier est inférieur à 3 $ l'unité. De plus, nous avons mené des expériences en laboratoire dans des conditions de température et d'humidité élevées, typiques des pays à revenu faible et intermédiaire, afin de vérifier leur efficacité dans ces environnements. À 35 °C et 90 % d'humidité, la corrélation entre les taux d'ALT, d'AST et d'ALB et les mesures de l'analyseur biochimique clinique Mindray BS350s était supérieure à 0,95. La répétabilité des contrôles qualité Randox était inférieure à 7,5 %, conformément à la norme chinoise relative aux analyseurs chimiques secs. Le coefficient de variation (CV) des ALT et AST était inférieur ou égal à 12 % dans la plage de concentrations de 40 à 60 U/L, et inférieur ou égal à 5 ​​% dans la plage de concentrations de 100 à 300 U/L, satisfaisant ainsi à l'exigence d'un CV inférieur à 7,5 % mentionnée dans le manuel de la plupart des analyseurs biochimiques secs POCT disponibles sur le marché. Ce dispositif et sa carte de test papier peuvent être utilisés dans les pays à revenu faible et intermédiaire pour répondre aux besoins de détection rapide des indicateurs de lésions hépatiques.

En résumé, l'analyseur POCT et ses réactifs ou cartes de test associés proposés dans cet article présentent les avantages suivants :
1. Une formation simple suffit pour que les agents de santé de premier recours puissent l'utiliser ; 2. Le système sur support papier est facile à utiliser et à entretenir ; 3. Les trois dosages quantitatifs (ALT, AST et ALB) peuvent être effectués simultanément, en moins de 3 minutes, avec un volume sanguin inférieur à 45 µL ; 4. Plage de détection étendue : ALT : 10-800 U/L, AST : 10-800 U/L et ALB : 10-60 g/L ; 5. Les résultats peuvent être obtenus à 35 °C et 90 % d'humidité relative sans incidence sur les résultats ; 6. Alimentation par batterie au lithium, fonctionnement indépendant des conditions environnementales du laboratoire ; 7. Enfin, le coût des tests est très faible. Ces avantages sont aujourd'hui essentiels pour les pays à revenu faible et intermédiaire. Ce dispositif offre non seulement une méthode novatrice et efficace pour la détection rapide des lésions hépatiques dans les pays à revenu faible et intermédiaire, mais favorise également le développement de dispositifs de diagnostic au point de soins pour la surveillance d'autres analytes cliniquement importants.

REMERCIEMENTS

L’étude des conditions de fonctionnement et des performances des tests présentée dans cet article a été financée par la Fondation pour les nouveaux diagnostics innovants (FIND).

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